瘦素调控大鼠肝纤维化的信号转导机制及保肝宁的干预作用

科研工作来源:国家自然基金资助项目(30672769);广东省中医药局资助项目(1050128)。 研究背景:肝纤维化(hepatic fibrosis,HF)主要是由肝脏内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的合成大于降解,致使ECM在肝脏内过度沉积所致。它是大多数慢性肝病所共有的病理特征,也是慢性肝炎、肝硬化等进一步发展、恶化的重要中间环节。据统计,我国患慢性乙型肝炎的病人超过3000万,每年死于肝炎后肝硬化者有40万人,而治愈肝硬化的唯一途径是阻断肝纤维化。迄今为止,全世界包括我国在内的国家尚没有批准一个抗纤维化西药,中医药抗肝纤维化的实验和临床研究已凸现其特有的优势,其中尤以复方中药抗肝纤维化的多靶点治疗作用更为引人注目。 我们在全面认识慢性肝病肝纤维化病因病机的基础上,研制出抗肝纤维化新方保肝宁,它寓疏肝解郁、益气健脾;活血化瘀、软坚散结;兼清热利湿解毒等重要治法于一体,应用于临床,疗效卓著。在国家自然科学基金、广东省自然科学基金的资助下,我们开展了保肝宁抗肝纤维化的信号转导机制研究。保肝宁抑制HSC增殖作用可能与NF-κB信号转导通路有关,保肝宁能明显降低HSC细胞NF-κB的表达及IκB的磷酸化。 瘦素(Leptin)是新发现的促肝纤维化的细胞因子,目前对瘦素促肝纤维化的分子机制研究,国外刚刚起步,国内相关文献报道更加少有。因此,我们认为系统的研究瘦素及其信号转导机制,并在此基础上探讨中药保肝宁对瘦素、瘦素受体及受体后介导的信号转导通路的影响,有助于进一步阐明其抗肝纤维化的作用途径和作用靶点,为保肝宁防治和逆转肝纤维化提供更加充分的理论依据,同时,对于深化和完善肝纤维化的机制研究具有十分重要的理论意义。 目的和意义:探讨保肝宁抗肝纤维化的分子机制,为保肝宁应用于临床提供充分的理论依据,为开发抗肝纤维化新药保肝宁奠定坚实的理论基础。 研究方法:以复合因素诱导的肝纤维化模型大鼠为研究对象,观察保肝宁(方药由黄芪、桃仁、丹参、黄芩、鳖甲等组成)对模型大鼠瘦素及其信号转导通路的影响。 50只Wistar大鼠随机分为5组,即正常对照组(A组)、模型组(B组)、秋水仙碱组(C组)、保肝宁大剂量组(D组)、保肝宁中剂量组(E组)。除A组外,其余大鼠于实验第1d每只皮下注射40%(体积分数)CCl_4花生油0.5ml·100g~(-1);以后每3日注射0.3ml·100g~(-1)。除A组外,各组均以普通饲料喂养,并以5%乙醇为饮料。A组注射等量花生油,进食普通饲料并自由饮水。各组从造模第2天开始,每日给相应药物灌胃,C组每日灌服秋水仙碱0.011mg·100g~(-1),D、E组分别每日灌服保肝宁3.54g·100g~(-1)、1.77g·100g~(-1),B组及A组灌以等量蒸馏水作对照。第6厨末,处死动物,取血和肝组织备用。取新鲜肝组织梯度置于-70℃中保存,用于蛋白印迹实验(Western blotting analysis);一部分肝组织固定于10%中性福尔马林溶液,肝组织常规脱水,石蜡包埋,切片厚5μm,做光镜观察和免疫组化用;血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性;总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)采用全自动生化分析仪检测;放免法测定血清瘦素(Leptin)水平;光学显微镜下观察肝组织病理学变化;免疫组织化学技术检测瘦素(Leptin)及瘦素受体(OB-Rb)等的表达水平;应用蛋白印迹试验(Western blotting analysis)检测瘦素受体(OB-Rb),JAK2(Janus激酶,Januskinase)和转录活化因子(STAT3)蛋白的表达水平以及它们的磷酸化水平。统计学处理:计量资料用平均值±标准差(x±s)表示,数据处理采用SPSS14.0统计软件包进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。 研究内容和过程: 1.观察保肝宁对模型大鼠的症状、体征及肝、脾指数的影响 模型组大鼠精神不振、消瘦、厌食,饮水减少,大便稀溏,小便色黄而少;肝脏表面较正常组欠光滑,颜色浅,边缘钝,质地硬,部分标本表面凹凸不平,呈小结节状;脾脏明显肿大,呈暗红色。各药物组大鼠精神状态、毛色泽、饮食饮水、排便等一般情况均明显改善,以保肝宁各组改善情况为佳。在增加体重方面,与模型组比较,秋水仙碱、保肝宁大、中剂量均能显著增加大鼠体重(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01);各药物组比较差异无显著性意义(p＞0.05)。各药物组大鼠肝脏表面较光滑,颜色较红;脾脏与正常组大鼠相比较无明显差异。与正常组比较,模型组、各药物组肝指数均明显增加,差异有非常显著性意义(P均＜0.01),模型组脾脏指数亦明显升高,差异有非常显著性意义(P均＜0.01);与模型组比较,各药物组均能显著降低模型大鼠肝、脾指数,差异有显著性意义(P均＜0.01);其中,保肝宁大剂量组降低肝指数的作用明显优于秋水仙碱组,差异有显著性意义(p＜0.05)。 2.观察保肝宁对肝纤维化大鼠肝组织形态学的影响 光镜观察显示:模型组正常肝小叶结构破坏,肝索排列紊乱,可见肝细胞点状坏死,肝细胞空泡变性散在分布,间质增生明显,胶原纤维构成的纤维间隔形成,形成较多完整的假小叶。各药物组肝小叶样结构明显改善,胶原纤维间隔较少,肝细胞坏死、炎性细胞浸润少见,但极少数大鼠仍有不完全性假小叶。 3.保肝宁对模型大鼠血清肝功能、血脂的影响 与正常组比较,模型组血清ALT、AST、AST/ALT比值均明显升高(P均＜0.01),各药物组ALT、AST水平亦明显升高(P均＜0.01);与模型组比较,各药物组血清ALT、AST活性明显下降,差异有非常显著性意义(P均＜0.01),保肝宁中剂量组AST/ALT比值也明显下降,差异有显著性意义(P＜0.05);保肝宁大剂量组降低AST作用明显优于秋水仙碱(P＜0.05)。与正常组比较,模型组及各药物组血清TC、TG水平明显下降,差异有非常显著性意义(P＜0.01);与模型组比较,保肝宁大、中剂量组血清TC、TG水平明显升高,差异有非常显著性意义(P均＜0.01)。其中,保肝宁大剂量升高TC作用明显明显优于秋水仙碱组(P＜0.05),保肝宁大、中剂量组升高TG作用均明显优于秋水仙碱组(P均＜0.05)。 4.保肝宁对模型大鼠血清瘦素(Leptin)水平的影响 与正常组比较,模型组及各药物组血清Leptin水平明显升高,差异有非常显著性意义(P＜0.01);与模型组比较,各药物组则明显下降(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05);各药物组降低Leptin作用,差异无显著性意义(P＞0.05)。 5.保肝宁对肝纤维化大鼠肝组织瘦素(Leptin)及瘦素受体(OB-Rb)的影响 (1)Leptin的表达:正常组肝细胞内呈阴性或极弱阳性表达,偶见于汇管区、小叶中央静脉周围及肝索Disse腔间隙中。模型组肝内Leptin表达明显增强,数目增多,呈棕黄色胞质型分布;小叶中央静脉周围、汇管区及肝小叶内均有大量条索状、星芒状瘦素阳性表达,高倍镜下,阳性表达主要分布于HSC胞质中。各药物组阳性染色程度较模型组明显减轻,阳性细胞数目减少。统计学显示,与正常组比较,模型组、各药物组Leptin表达明显增多,差异有非常显著性意义(P＜0.01);与模型组比较,各药物组均可以降低Leptin的表达,差异有显著性意义(p＜0.01);各药物组两两比较差异无显著性意义(P＞0.05)。 (2)OB-Rb表达:正常组肝细胞内呈阴性或极弱阳性表达,偶见于汇管区、小叶中央静脉周围及肝索Disse腔间隙中。模型组肝内表达明显增强,数目增多,呈棕黄色胞质型分布;高倍镜下,阳性表达主要分布于非实质细胞(包括肝星状细胞、窦内皮细胞、枯否细胞等)胞质及胞膜上,部分可定位于核。统计学显示,与正常组比较,模型组、各药物组OB-Rb表达明显增多,差异有显著性意义(P均＜0.01);与模型组比较,各药物组OB-Rb表达均无明显变化,差异无显著性意义(P均＞0.05);各药物组OB-Rb的表达两两比较差异无显著性意义(P＞0.05)。 6.保肝宁对肝纤维化大鼠肝组织瘦素受体(OB-Rb)及其JAK2-STAT3信号转导通路的影响 (1)OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表达。用Western Blot法检测肝脏组织细胞内OB—-b、JAK2、STAT3蛋白表达情况,正常组蛋白表达量最少,保肝宁和秋水仙碱处理组蛋白条带颜色均较浅,模型组条带颜色最深。与正常组比较,模型组、保肝宁大、中剂量组和秋水仙碱组OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白程度均增高;与模型组相比,各药物组的OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表达显著降低;保肝宁大、中剂量组和秋水仙碱组相比,OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白显著降低。 (2)JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平。用Western Blot法检测肝脏组织细胞内JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,正常组蛋白磷酸化水平最低,保肝宁和秋水仙碱处理组蛋白条带颜色均较浅,模型组条带颜色最深。与正常组比较,模型组、各药物组P-JAK2、P-STAT3蛋白表达水平均增高;与模型组相比,各药物组的P-JAK2、P-STAT3蛋白表达显著降低;保肝宁大、中剂量组和秋水仙碱组相比,P-JAK2、P-STAT3蛋白水平显著降低。 结论:保肝宁能有效的阻止模型大鼠肝纤维化进程,其作用机制为: 1.保肝宁可以有效的改善肝纤维化模型大鼠的一般情况:如改善模型大鼠的精神状况,增加体重,改善食欲和饮水等症状,提高大鼠生存质量;显著降低模型大鼠肝、脾指数。 2.形态学观察表明保肝宁能明显改善破坏的肝小叶结构,减轻纤维组织增生;明显减少胶原纤维间隔、肝细胞坏死以及炎性细胞的浸润等。 3.保肝宁明显降低纤维化模型大鼠血清ALT、AST含量,TG、TC水平明显升高,提示保肝宁能有效减轻炎症反应,调节血脂水平,保护肝细胞,从而抑制早期肝纤维化的启动。 4.保肝宁明显降低纤维化模型大鼠血清Leptin水平,有效的阻止了Leptin与OB-Rb结合而发挥的诱导HSC活化和增殖作用。 5.保肝宁明显抑制纤维化模型大鼠肝组织Leptin的表达,明显减轻Leptin阳性染色程度,减少阳性细胞数目,提示Leptin是保肝宁抗肝纤维化的作用靶点之一。 6.保肝宁有效抑制纤维化模型大鼠肝组织OB-Rb以及其信号转导分子JAK2、STAT3的蛋白表达,显著降低JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,提示保肝宁具有抑制OB-Rb及其信号转导作用,这可能是其抗肝纤维化的分子机制之一。 综上所述,保肝宁具有综合抗肝纤维化的药理作用,其作用机制为多途径、多靶点。抑制Leptin的表达、抑制OB-Rb及其JAK2/STAT3信号转导通路,可能是其抗肝纤维化的分子机制之一。而这一机制与抑制炎症反应,调节血脂水平,保护肝细胞,减少细胞因子所产生的瀑布效应,从而抑制肝纤维化的启动密切相关。

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